CRISPR/Cas9核酸酶表達(dá)載體是當(dāng)前幾種流行的基因編輯工具之一，可以快速有效地在基因組靶序列上創(chuàng)造突變（其它兩種常見(jiàn)的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引導(dǎo)DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點(diǎn)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點(diǎn)。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標(biāo)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Cas9和特異gRNA。這可以通過(guò)在同一個(gè)載體上共表達(dá)Cas9和gRNA，也可以通過(guò)在兩個(gè)載體各上自表達(dá)Cas9和gRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個(gè)載體分開(kāi)表達(dá)的優(yōu)勢(shì)在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如Cas9n，dCas9），從而帶來(lái)更多變的實(shí)驗(yàn)方案。

我們的常規(guī)Cas9表達(dá)質(zhì)粒載體可以直接轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，方法如同大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法一樣，操作上非常簡(jiǎn)便。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染要注意的是，這種方法屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，只有極小一部分的細(xì)胞中的質(zhì)粒序列會(huì)穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中（整合幾率的典型值小于1%）。

我們提供多種版本的來(lái)源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對(duì)靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，包含D10A和H840A突變，屬于無(wú)核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強(qiáng)化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強(qiáng)化的SpCas9。dCas9融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域后，如dCas9/KRAB，可分別應(yīng)用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來(lái)源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來(lái)源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時(shí)，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯(cuò)開(kāi)，形成粘性末端）。

點(diǎn)擊此處查看我們提供的Cas9類型

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的Cas9表達(dá)載體可使用用戶自定義的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)Cas9蛋白的高水平表達(dá)。我們提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求。Cas9表達(dá)載體系統(tǒng)已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，且對(duì)細(xì)胞具有高效轉(zhuǎn)染率。根據(jù)用戶選擇的篩選標(biāo)記基因，可對(duì)轉(zhuǎn)染了該載體的細(xì)胞進(jìn)行篩選或者可視化追蹤。

瞬時(shí)表達(dá)：轉(zhuǎn)染Cas9表達(dá)質(zhì)粒載體可以在靶細(xì)胞中獲得高水平的Cas9蛋白表達(dá)瞬時(shí)峰值。在無(wú)藥篩的情況下，基因編輯完成后Cas9質(zhì)粒載體會(huì)逐漸從細(xì)胞中丟失。

靈活性：Cas9表達(dá)質(zhì)粒載體可與多種不同的gRNA共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中以打靶多個(gè)位點(diǎn)。

技術(shù)簡(jiǎn)單：常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。

高水平表達(dá)：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞多達(dá)幾千拷貝），使外源基因能高水平表達(dá)。

載體DNA非整合型：常規(guī)質(zhì)粒在細(xì)胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也稱為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。然而，質(zhì)粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每10²~10⁶個(gè)細(xì)胞可能會(huì)有一個(gè)細(xì)胞的基因組被整合，整合效率取決于細(xì)胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，在經(jīng)過(guò)擴(kuò)大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細(xì)胞分選來(lái)獲得穩(wěn)定整合了該載體的細(xì)胞。

可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型受限：不同類型細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異很大。非分裂細(xì)胞比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。一些重要的細(xì)胞類型更是難以轉(zhuǎn)染，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，很少運(yùn)用到活體實(shí)驗(yàn)。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。而病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更傾向于相對(duì)均勻地把基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點(diǎn)時(shí)對(duì)gRNA識(shí)別序列3'端的PAM序列有嚴(yán)格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

CRISPR/Cas9核酸酶表達(dá)載體是當(dāng)前幾種流行的基因編輯工具之一，可以快速有效地在基因組靶序列上創(chuàng)造突變（其它兩種常見(jiàn)的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引導(dǎo)DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點(diǎn)通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點(diǎn)。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標(biāo)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Cas9和特異gRNA。這可以通過(guò)在同一個(gè)載體上共表達(dá)Cas9和gRNA，也可以通過(guò)在兩個(gè)載體各上自表達(dá)Cas9和gRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個(gè)載體分開(kāi)表達(dá)的優(yōu)勢(shì)在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如Cas9n，dCas9），從而帶來(lái)更多變的實(shí)驗(yàn)方案。

我們的常規(guī)Cas9表達(dá)質(zhì)粒載體可以直接轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，方法如同大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法一樣，操作上非常簡(jiǎn)便。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染要注意的是，這種方法屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，只有極小一部分的細(xì)胞中的質(zhì)粒序列會(huì)穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中（整合幾率的典型值小于1%）。

我們提供多種版本的來(lái)源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對(duì)靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，bao'hanD10A和H840A突變，屬于無(wú)核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強(qiáng)化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強(qiáng)化的SpCas9。dCas9融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域后，如dCas9/KRAB，可分別應(yīng)用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來(lái)源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來(lái)源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時(shí)，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯(cuò)開(kāi)，形成粘性末端）。

點(diǎn)擊此處查看我們提供的Cas9類型

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的Cas9表達(dá)載體可使用用戶自定義的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)Cas9蛋白的高水平表達(dá)。我們提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求。Cas9表達(dá)載體系統(tǒng)已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，且對(duì)細(xì)胞具有高效轉(zhuǎn)染率。根據(jù)用戶選擇的篩選標(biāo)記基因，可對(duì)轉(zhuǎn)染了該載體的細(xì)胞進(jìn)行篩選或者可視化追蹤。

瞬時(shí)表達(dá)：轉(zhuǎn)染Cas9表達(dá)質(zhì)粒載體可以在靶細(xì)胞中獲得高水平的Cas9蛋白表達(dá)瞬時(shí)峰值。在無(wú)藥篩的情況下，基因編輯完成后Cas9質(zhì)粒載體會(huì)逐漸從細(xì)胞中丟失。

靈活性：Cas9表達(dá)質(zhì)粒載體可與多種不同的gRNA共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中以打靶多個(gè)位點(diǎn)。

技術(shù)簡(jiǎn)單：常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。

高水平表達(dá)：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞多達(dá)幾千拷貝），使外源基因能高水平表達(dá)。

載體DNA非整合型：常規(guī)質(zhì)粒在細(xì)胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也稱為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。然而，質(zhì)粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每10²~10⁶個(gè)細(xì)胞可能會(huì)有一個(gè)細(xì)胞的基因組被整合，整合效率取決于細(xì)胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，在經(jīng)過(guò)擴(kuò)大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細(xì)胞分選來(lái)獲得穩(wěn)定整合了該載體的細(xì)胞。

可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型受限：不同類型細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異很大。非分裂細(xì)胞比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。一些重要的細(xì)胞類型更是難以轉(zhuǎn)染，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，很少運(yùn)用到活體實(shí)驗(yàn)。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。而病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更傾向于相對(duì)均勻地把基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點(diǎn)時(shí)對(duì)gRNA識(shí)別序列3'端的PAM序列有嚴(yán)格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.